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      分光光度計在核酸的定量上也起著重要作用
      發布時間:2021-09-26   點擊次數:351次
        分光光度計在核酸的定量上也起著重要作用
        分光光度計是指,使單色儀或特殊光源供給的特定波長的單色光通過標準試樣和被分析試樣,比較兩者的光強度分析物質成分的分光器。已經成為現代分子生物實驗室的常規儀器。
        核酸的定量是分光光度計使用頻率比較高的功能??梢詫扇苡诰彌_液中的寡核苷酸、單鏈、雙鏈DNA和RNA進行定量。核酸最高吸收峰的吸收波長為260nm。由于每個核酸的分子結構不同,因此其換算系數不同。要對不同類型的核酸進行定量,需要預先選擇對應的系數。測試后的吸光值經過上述系數的換算,得到了相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的步驟,輸入原液和稀釋液的體積,然后測試空白液和樣品液。但是,實驗并不順利。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的機器,吸光值的漂移越大。
        事實上,分光光度計的設計原理和工作原理允許吸光值在一定范圍內變化。也就是說,儀器有一定的精度和精度。另外,還需要考慮核酸本身的化學性質和溶解核酸的緩沖液的pH、離子濃度等。測試時離子濃度過高時,讀取值有時會漂移,因此推薦使用像TE這樣pH值恒定、離子濃度低的緩沖液。
        樣品的稀釋濃度也是不可忽視的因素:因為樣品中不可避免地存在細小的粒子,特別是核酸樣品。這些小粒子的存在會干擾測試效果。為了將粒子對檢查結果的影響控制在最小限度,核酸的吸光值優選至少大于0.1A,吸光值優選為0.1-1.5A。在這個范圍內,粒子的干擾比較小,結果穩定。因此,這意味著樣品的濃度不能過低或過高(超出光度計的測試范圍)。
        最后是操作要素。如果混合不充分,吸光值太低,會出現負值?;旌弦褐胁荒艽嬖跉馀???瞻滓褐袥]有懸浮物。否則,讀數漂移會很劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品。不這樣做的話,濃度差異太大了;換算系數和樣品濃度單位的選擇一致;窗戶磨損的彩杯不能采用;樣品的體積必須達到彩杯所要求的最小體積等,有很多操作事項。
        除了核酸濃度,分光光度計還同時給出了一些非常重要的比值,代表了樣品的純度。例如,A260/A280之比因為蛋白的吸收峰為280nm,所以用于評價樣品的純度。純樣本比大于1.8(DNA)或2.0)RNA)。比值小于1.8或2.0時,表示有蛋白質或酚類的影響。A230表示樣品中存在碳水化合物、多肽、苯酚等污染物,比較純凈的核酸A260/A230之比大于2.0。檢測A320溶液的濁度和其他干擾因素。純樣品,A320一般為0。
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